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奥扎格雷丹参酮IIA联合对大鼠肢体缺血再灌注损伤的影响及机制研究

  

吴玉杰  张莹  常占平  门秀丽   

河北省秦皇岛市第三医院心内科医生

摘要:目的:探讨奥扎格雷注射液丹参酮IIA磺酸钠注射液联合对肢体缺血再灌注损伤的治疗作用。方法:健康成年SD大鼠50只,随机分为模型组,肢体缺血再灌注组,丹参酮IIA组,奥扎格雷组,联合组每组10只,建立大鼠肢体缺血再灌注损伤动物模型,在恢复血流灌注30分钟前分别于肢体缺血再灌注组腹腔注射生理盐水,丹参酮IIA组腹腔注射丹参酮IIA牛黄酸注射液,奥扎格雷组腹腔注射奥扎格雷注射液,联合组腹腔注射奥扎格雷及丹参酮IIA注射液,模型组不给予任何处理。在结扎4h后松解,松解2h后腹主动脉取血,测定血清LDH、CK、MbTXA2PGI2的含量,后腿骨骼肌组织及血浆中MDA、SOD、XOD含量。电镜及光镜观察骨骼肌组织结构变化。结果再灌注后联合组LDH、CKMbTXA2PGI2明显低于其他组(P<0.05),MDA、SOD、XOD亦有显著差异,光镜及电镜下观察骨骼肌损伤轻于其他组。结论:两药联合对缺血再灌注骨骼肌保护作用较好。

关键词:奥扎格雷丹参酮IIA联合;肢体,缺血再灌注;损伤  

Abstract: goles: probe medicall effect on Ozagrel tanshinone IIA sodium injection to blood shortage of joint skeletal muscle

Method: healthy adult SD rats 50 divided into model group random, flood group whom limbs ischemia, tanshinone IIA group, ozagrel group, 10 rats in each group, eastablish injure animal model which limbs ischemia.Blood was pouring 30 minutes before, saline water need poured into full set of abdominal, Ligation end after 4h,2h after the determination to take blood serum to examine the content of LDH, CK, Mb,TXA2,PG12, and content of MDA for skeletal muscle hind legs in the organization and plasma.Observe the organization change through electric mirror and light microscope. Results after the joint group LDH,CK,and TXA2,PG12 markedly lower than other groups ( p < 0.05 ), the MDA,SOD,XOD also shows significant differences, the mirror and skeletal muscle damage under observation through electric mirror is lighter than other groups.

Conclusion : two medicine to be implanted in blood shortage of joint skeletal muscle have better protection.

Key words: ozagrel tanshinone and IIA union; limbs; injection to blood shortage; injure.

 

肢体缺血再灌注是临床一种常见的病理过程,如肢体外伤挤压后,断肢再植,四肢大血管栓塞或损伤肢体手术应用止血带等恢复血流灌注后,不仅缺血组织出现更严重损伤,可以进一步导致远隔器官的损伤.其发病率和死亡率很高.奥扎格雷及丹参酮IIA磺酸钠注射液近年来在治疗心血管疾病临床应用较为广泛,可显著改善微循环供血,但两药联合对肢体缺血再灌注损伤疗效还未曾有研究

1材料与方法

1.1动物分组及模型的建立

健康SD大白鼠50只,随机分为模型组,肢体缺血再灌注组(I)丹参酮IIA组(II组),奥扎格雷组(III组),奥扎格雷与丹参酮IIA两药联合组(IV组)每组10只后四组均为缺血再灌注损伤(IR),采用Rosenthul(1)法复制大鼠肢体缺血再灌注损伤模型。25%乌拉坦0.8ml腹腔注射麻醉下以橡皮带环绕结扎各组大鼠双后肢根部模型组不结扎,阻断血流灌注4h,于松解前30分钟II组从腹腔注射丹参酮IIA磺酸钠注射液(上海第一生化药业有限公司,国药准字H310225581)25mg/kgI组腹腔注射生理盐水10mg/kgIII组腹腔注射奥扎格雷注射液33.67mg/kg(汕头八大制药有限公司,国药准字H20058033)IV组分别按单药剂量腹腔注射奥扎格雷与丹参酮IIA,模型组不结扎不给药。

1.2检测项目及方法

IIIIIIIV组、分别于结扎4h后松解,恢复血流灌注,再灌注2h后自腹主动脉取血样,并取左侧后肢胫前肌肉组织。

1.2.1血清骨骼肌酶学CK、LDH、Mb的测定 采用美国贝克曼CX-4型全自动生化分析仪测定血清中CK、LDH、Mb的含量(u/g)测定试剂盒购自南京建成生物研究所。测定血清TXA2PGI2试剂盒购自北京北方生物技术研究所,采用北京核仪器厂FT-630G放免仪分析

1.2.2骨骼肌组织与自由基相关指标测定 取后肢胫前组织制成10%的匀浆3000转/分,离心取上清测定MDA、XOD、SOD含量。试剂盒购自南京建成生物研究所,检测均严格按照试剂盒说明操作。  

1.2.3 石蜡切片制备及光镜观察,每组各选两只动物胫前骨骼肌标本10%甲醛固定,常规脱水,包埋,切片,脱蜡,HE染色,透明,封片。

1.2.4 电镜观察骨骼肌细胞超微结构变化:取胫前骨骼肌组织2.5%戊二醛固定修块后,丙酮脱水,环氧树脂618包埋,超薄切片,染色,JEM-100CX透射电子显微镜观察并摄片。

1.3统计学处理

数值以均数±标准差表示。采用单因素方差分析q检验统计处理。p<0.05为差异显著, p<0.01为有极显著性差异。

2.结果

2.1 血清CK  LDH  Mb TXA2 PGI2变化

2.1.1 血清CK  LDH  Mb缺血再灌注后各组值与模型组比较均明显增高,IV组CK、LDH、Mb、TXA2各值明显低于I、II、III组,而IV组PGI2高于其他各组。 见表1

  两组血清CK  LDH  Mb TXA2 PGI2值比较(表1)

组别

CK(u/l)

LDH(u/l)

Mb(u/l)

TXA2(pg/ml)

PGI2(pg/ml)

模型组

473±475

1182±447

3.3±1.7

627±101

138±46.7

I

3720.7±932.3#

4145.8±619.2#

31±13#

2890.1±675.9#

196.3±101.7#

II

3542.1±1109.9#

3453.5±321.5#

20.5±11.5#

2665.6±498.7#

201.6±88.3#

III

3658±985.6#

3846.7±402.3#

23±11.8#

234.4±94.5#@

275.9±167.4#@

IV

3185.2±876##^^

2978.1±387.3##^^

17.8±8.9

211.2±78.5^^

306.1±76.3^^

#P<0.05,与模型组比较;##p<0.05,与II组比较;^^p<0.05,与III组比较。@ p<0.01,与II组比较

2.2骨骼肌组织中MDA  XOD  SOD的值(表2)

组别

MDA

XOD

SOD

剂量

Umol/g.w.w

u/mg.prot

Nu/mg.prot

模型组

101.3±78.4

26.7±9.6

1834. ±1039

I

287.7±124.06*

43.1±10.7*

5304.8±1921*

II

208.8±179.2*

35.7±16.4*

6679.7±1787*

III

234.6±119.4*

39.8±1*1

5480.2±1432*

IV

191.4±113.7*#

28.1±12.4*#

6787.3±1356*#

与模型组比较,*p<0.05;与I组比较# p<0.05。

2.3 显微结构的变化

2 3.1  光镜观察 缺血再灌注组肌纤维明显水肿,横纹消失,部分肌纤维断裂、溶解,出现空泡,肌浆凝固,肌核固缩(图1)联合组表现较轻部分肌纤维轻度肿胀,间质轻度水肿,肌核接近正常(图2)

 

部分肌纤维断裂、溶解,出现空泡,肌浆凝固,肌核固缩(图1)

 

肌纤维轻度肿胀,间质轻度水肿,肌核接近正常(图2)

                    

2 3.2  电镜观察  

缺血再灌注组肌丝排列紊乱,疏松,局灶肌丝溶解断裂线粒体肿胀。(图3)                   

联合组肌丝排列尚整齐,肌节、三联体基本正常,线粒体轻度肿胀。(图4)

 

讨论

   止血带模型是将止血带置于肢体近端可迅速阻断动静脉血流,此模型操作简单广泛用于狗、兔、猪 、大鼠各种动物实验研究,已经过激光、多普勒 血流仪监测血流情况,证实模型成功,大量应用于临床教学实验中。

   氧自由基具有高度活性和细胞毒性,破坏膜功能使细胞的完整性及离子渗透功能遭到破坏,并使微血管和肌细胞遭受损害(2),通过检测MDAXODSOD测定血及组织中氧自由基指标。丹参酮IIA为丹参根部的乙醇提取物,具有天然抗氧化作用是丹参的主要药理活性物质。本实验证实缺血再灌注2hMDAXOD含量均明显高于模型组而SOD明显低于模型组,这说明缺血再灌注后氧自由基大量产生。骨骼肌再灌注损伤的发生与机体内自由基产生增多和清除减少密切相关。而丹参酮IIA组及联合用药组动物血浆及组织中XODMDA值虽然高于模型组,但与I组与III组比较明显降低,SOD明显升高并且骨骼肌酶学指标改善说明丹参酮IIA对骨骼肌有明显的保护作用。其机制与其减少自由基的产生和增加自由基的清除有关。

   血栓素/前列腺素  是花生四烯酸产物血栓素A2(TXA2)具有很强的血管收缩,促进血小板聚集和粒细胞脱颗粒反应作用,增加血管阻力和通透性(3)与PGI2作用相反,肌肉缺血再灌注时,中性粒、血小板、巨噬细胞被激活大量生成TXA2血栓生成,收缩血管,组织缺血、缺氧造成TXA2PGI2的动态平衡紊乱,影响微循环。本实验观察到,联合组TXA2显著低于IIIP0.05.PGI2明显高于I、II组,说明奥扎格雷抗凝抑制血栓形成,间接改善微循环改善供血,与丹参酮IIA联用增加其抗凝作用。 

肌细胞内含有丰富的CK、LDH、Mb肌细胞在缺血缺氧下,肌细胞内酶迅速释放入血。通过测得肌细胞酶学指标判断细胞损伤程度。实验发现缺血再灌注各组骨骼肌酶指标均明显高于模型组,而IV组酶学指标明显低于单一用药组,说明两药联合对骨骼肌细胞的保护作用强于单一用药效果。

目前骨骼肌缺血再灌注损伤各种机制的发生时间及相互关系尚未阐明。一般认为,针对肢体缺血再灌注损伤早期对多个环节及靶点进行保护。抑制损伤发展或进行加重联合治疗是重要措施之一。一直以来国内外对缺血性脑卒中的联合用药疗效相对较多,研究均表明,单一应用自由基清除剂的治疗不会有显著效果,应联合用药治疗阻断损伤的多个环节为佳(4)本实验结果也证实,采用联合用药效果较好,原因在于联合用药可作用在多个环节的缘故。

综上所述,奥扎格雷、丹参酮IIA磺酸钠注射液联合治疗肢体缺血再灌注损伤比单一用药疗效显著。通过多靶点多环节作用,缩短病程,应用于临床可减轻病人痛苦。但这两种药物抗凝效果影响凝血,因此临床应用需严格掌握剂量,临床效果有待进一步观察及研究。

 

参考文献:

[1]Rosenthal SM.Experimental chemolherapy ef burns and shock IV.Production of traumatic shock in mice。Public Heath Rep,1943,58:1429

[2、3] 鲁力、张俐,骨骼肌缺血再灌注损伤机制研究进展,中国中医骨伤科杂志2005.13(6).R 685

[4]倪长江,陈兴洲,李宏建缺血性神经元死亡的信号传导[J].国外医学脑血管疾病分册,2001,9(4):196-202.

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