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蜂王浆对慢性酒精性肝损伤大鼠COX-2、 TNF-α的表达的影响


徐小冬1,俞利平2,尹洪萍2 ,赵建军1   

1.杭州师范大学基础医学部人体解剖教研室

2 . 杭州师范大学实验动物中心  

摘要:目的:观察COX-2和TNF-α在酒精性肝损伤大鼠肝脏中的表达及蜂王浆对其表达的影响。方法:雄性SD大鼠,随机分为3组.对照组用生理盐水灌胃;模型组用56%红星二锅头+玉米油+吡唑灌胃;干预组在模型组的基础上同时给予蜂王浆1.0g/kg/d灌胃,共12周。实验结束后处死大鼠,全自动生化分析仪检测血清中天门冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、血清白蛋白(A)等。HE染色观察肝脏组织病理学改变,免疫组织化学SABC法检测COX-2TNF-α的表达,利用Olympus DP70显微成像系统和Image-prodiscovery5.1图像分析系统对其行定量分析结果:模型组肝细胞损伤明显,治疗组有所改善。模型组大鼠血清AST、ALT、A较对照组明显升高( P < 0.05) ;与模型组相比,蜂王浆组大鼠血清ALT、AST明显降低, A升高 ( P均 < 0.05) 。免疫组化和图像分析均显示, 模型组肝组织中COX-2及TNF-α表达较对照组明显升高( P < 0.01) ,蜂王浆组较模型组明显下降( P < 0.05) 。结论:蜂王浆在酒精性肝病的形成过程中能够抑制COX-2TNF-α的表达,对酒精性肝损伤有一定的保护作用。

关键词】肝损伤,酒精性;环氧合酶-2;肿瘤坏死因子;

 

Abstract: Objective  To observe expression of the cox-2 and TNF-α in alcoholic rat liver injury  and  Royal jelly impact on its expression. Methods: SD rats with 40, were randomly divided into 3 groups. The control group (15) administered with normal saline; 56 percent by drinking red star Erguotou + corn oil + pyrazole for rat model of alcoholic liver disease (total 15), a total of 12 weeks; intervention group (10) in the model group based on the granting of royal jelly 1.0g/kg/d-1, administered a total of six weeks. the end of the experiment rats were killed, automatic biochemical analyzer serum aspartate transaminase (AST), alanine aminotransferase (ALT), albumin (A), etc., HE staining of liver histopathological changes. SABC immunohistochemical assay COX-2 and TNF-α expression, Olympus DP70 microscopy imaging system and Image-prodiscovery5.1 image analysis system were used for quantitative analysis of their trip. Results: The model group, liver cell injury Obviously, the treatment group improved. Model group, serum AST, ALT, A significantly higher than the control group (P <0.05); Compared with model group, royal jelly serum ALT, AST significantly reduced, A increased (P all <0.05). Immunohistochemistry and image analysis have shown that the model group of liver tissue COX-2 and TNF-α expression significantly higher than the control group (P <0.05), royal jelly group than in model group decreased significantly (P <0.05). Conclusion: The royal jelly in the formation of alcoholic liver disease process can inhibit COX-2 and TNF-α expression, have some protective effect on alcohol-induced liver injury.

Key words liver injury, alcoholic; Cyclooxygenase -2; tumor necrosis factor;

酒精性肝病(alcoahil liver diesaes,ALD)是指长期大量饮酒所致的慢性肝脏疾病,包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化以及酒精性肝硬化,严重酗酒时可诱发广泛肝细胞坏死甚或肝功能衰竭。根据流行病学调查,我国一般人群饮酒率为59.5%,酒精性肝病发病率约占饮酒者的20%[1]。而且随着人民生活水平的日益提高,饮酒人数的逐年增加,酒精性肝病有迅速增长的趋势,已成为危害国民健康的又一严重疾病。因此,防治酒精性肝病已成为医学研究的重要课题。蜂王浆的主要成分为蛋白质、脂肪、糖类、氨基酸、维生素和多种微量元素、多种酶和胰岛素类物质等[2] 。有关蜂王浆调节血糖血脂、增强免疫调节作用以及抗细菌、抗癌等方面的等均有报道[3],文献资料中蜂王浆对于护肝方面的报道并不多见,本研究旨在研究蜂王浆对酒精性肝损伤大鼠的保护作用,为蜂王浆在抗酒精性肝损伤方面提供一定的形态基础和理论依据。

1. 材料与方法

1.1实验动物及主要试剂   健康清洁级SD大鼠40只,雄性,体质量200-220g,,由杭州师范大学动物中心提供。56%红星二锅头白酒(北京红星酒业股份有限公司)。蜂王浆由杭州某蜂业保健品公司提供。COX-2单克隆抗体(1100)、SABC试剂盒及DAB显色剂,均购自武汉博士德公司。

1.2酒精性肝损伤动物模型的制备   雄性SD大鼠40只动物分笼饲养,每笼5只均用基础饲料喂养。随机分成3组,参照文献[8]的方法加以改进,对照组15只每天用生理盐水10ml.kg-1d-1灌胃;模型组(15)用白酒8-12g g.kg-1d-1+玉米油2ml.kg-1d-1+吡唑27.2mg.kg-1d-1,灌胃量每周递增2 ml.kg-1d-1直至总剂量达12 ml.kg-1d-1后以该量持续至12w结束。干预组(10只)在模型组的基础上给予蜂王浆1.0g/kg/d-1,12w

1.3实验方法  所有大鼠待12w实验结束时采血前12 h禁食禁水,麻醉后腹主动脉取血。采血后立即剖腹取肝脏,用锋利刀片在肝脏左中叶距边缘取部分肝脏标本放入10%甲醛溶液中固定用于组织病理学检查。

1.3.1血清ALT、ASTA测定由由贝克曼CX5全自动生化分析仪完成。

1.3.2病理学检查   石蜡切片作HE染色观察肝脏基本病理学改变。

1.3.3肝脏组织COX-2免疫组织化学SABC法染色  肝组织石蜡切片常规脱蜡至水,3 %过氧化氢灭活内源性酶后,用高温进行抗原修复,5 %BSA 封闭20 min ,滴加1100浓度特异性一抗后4 ℃过夜,次日滴加偶联二抗,室温30 min 后DAB 显色,苏木精复染,透明,封片。

1.3.4结果判断  免疫染色阳性为胞质棕黄色颗粒,细胞核不着色,每次实验均设阴性对照,以PBS 缓冲液代替一抗,结果显示阴性。

1.4 图像分析  利用Olympus DP70显微成像系统和Image-prodiscovery5.1图像分析系统行定量分析,每个标本各取两张,在同一放大倍率下随机选择三个不同视野,测量窗口区域内的积分光密度值,取其平均值来反应COX-2 的表达情况。

1.5统计学方法

  数据表示用x±s ,各组均数先进行方差齐性检验,等级资料采用x2检验,多组样本均数间两两比较采用q检验。所有统计均采用SPSS11. 5 统计软件包进行,P < 0. 05为有统计学意义。

2.结果

2.1 一般情况  模型组大鼠灌酒后行动迟缓,少数大鼠出现昏迷等醉酒状态,2-4小时可缓解,体重增加较对照组缓慢,大便较正常对照组稀,有的不成形,被毛较干枯蓬乱、缺少光泽,其中有5只大鼠因误入气管而死亡,干预组有3只大鼠死亡,对照组大鼠全部存活。

2.2 病理学改变  肝组织石蜡切片苏木精- 伊红染色显示,对照组肝细胞成单核多层状,肝板以中央静脉为中心呈放射状排列,个别肝细胞有少量空泡变性(图12)。模型组大鼠肝细胞胞质内出现大小不等的圆形空泡(图3)。与模型组比较,蜂王浆组大鼠肝组织空泡变性明显减轻,肝细胞内仅可见少量中小空泡(图69)。

    

        (图1)                     (图2

     

        (图3)                    (图4)      

         (图5)                   (图6    

       (图7)                  (图8

 

(图9

1 正常组肝小叶结构清晰,肝索排列整齐(HE×100)。

2 正常组肝板以中央静脉为中心呈放射状排列(HE×400)。

3 大鼠肝细胞胞质内出现大小不等的圆形空泡,有炎症细胞及坏死(HE×400)。

4、7对照组肝组织未见或少见COX-2和TNF-α的表达(免疫组化SABC×400)。

5、8模型组肝组织COX-2和TNF-α的表达明显增强(免疫组化SABC×400)。

69蜂王浆组肝组织COX-2和TNF-α的表达明显减弱(免疫组化SABC×400)。

2.3 血清ALT AST A 的水平

造模同时给予蜂王浆12周,大鼠血清A的水平与模型组比较具有统计学意义P<0.05)。ALT AST 明显低于模型组P均<0.05) (表1)。蜂王浆组AST/ALT比值大于21例,而模型组为8例(表2)。可见在酒精性肝病发展过程中,ALT AST A的水平发生了改变;模型组的基础上同时给予蜂王12周,ALT AST A的水平有所改善。 

1  对照组、模型组、蜂王浆组血清ALT AST A的水平

组别       n     ASTU/L)   ALTU/L)      A      

对照组      15    51.50±12.84    25.25±3.54      29.76±1.68

模型组      10    103.83±5.38    40.00±2.76      24.78±7.84

蜂王浆组    7     73.00±10.24    27.33±4.97      32.63±1.78     

2  模型组与蜂王浆组血清AST/ALT的匹格表

组别       n       比值>2        比值2        

模型组     10         8              2

蜂王浆组    7         1              6

合计       17         9              8

2.4 COX-2和TNF-α免疫组化结果

对照组肝组织未见或少见COX-2和TNF-α的表达,造模12周,可见表达其表达明显增强,主要位于细胞质内,呈颗粒状,多见于肝小叶中央静脉周围的肝细胞和汇管区增生肥大的库普弗细胞及小叶间静脉和动脉(58);积分光密度值分析显示,模型组COX-2和TNF-α的表达明显增加 (P<0.05,表2)。给予蜂王浆后,COX-2阳性颗粒明显减少,散在分布于细胞浆内(69),同模型组比较差异具统计学意义(P<0.05,表2).

3 对照组、模型组、蜂王浆组COX-2和TNF-α相对积分光密度值

组别       n             COX-2               TNF-α

对照组      15         0.2648±0.2329           0.3149±0.2201

模型组      10         0.5336±0.3487           0.5947±0.4866

蜂王浆组    7          0.3532±0.2509           0.2259±0.2034

 

2.5 肝生化指标,COX-2和TNF-α相关性Pearson双变量分析

采用双变量相关分析显示,ALT ASTCOX-2呈正相关(分别为r=0.432 0.454 P<0.05, ACOX-2呈负相关(r= -0.373 , P<0.05),COX-2与TNF-α呈正相关(r=0.457P<0.05)。

3.讨论

近年来的研究表明,酒精是肝细胞凋亡的诱导剂,在ALD的形成中起重要作用。环氧合酶-2( cyclooxygenase-2, COX-2)是新近发现的前列腺素(prostaglandin, PG)合成酶亚型,在多种细胞和组织的炎症过程及增殖中起重要作用,在炎症、癌前病变以及肿瘤中的作用成为研究的热点[4]。正常情况下,COX-2在正常大鼠肝脏组织不表达或低表达但在许多炎症因素刺激下表达升高[5]。在酒精性肝病中乙醇氧化时产生的过氧化产物,参与肝脏的炎症、坏死、纤维化形成等,其间形成的脂质过氧化物可以诱导COX-2基因表达,COx-2及其合成产物可以通过干扰脂肪、糖类及蛋白质的代谢,加重肝脏的氧应激和促进多种细胞因子的释放,损伤细胞器的膜结构 [6]。线粒体是细胞内的重要的膜性细胞器,线粒体膜结构的异常与细胞功能损伤相关联,ALT主要存在于细胞质中,而大约80%AST存在于线粒体内,临床上对酒精性肝病患者血清检测结果显示AST/ALT2的特点,也显示肝细胞的损伤主要在线粒体;本实验结果显示:蜂王浆组血清AST明显低于模型组,同时组内动物血清AST/ALT2的比例小于模型组。由此可知,蜂王浆对线粒体有保护作用,病理切片也显示蜂王浆组肝细胞脂肪变程度轻于模型组。Ganey等[7]报道,使用非损伤剂量的LPS和酒精处理大鼠,在ALT和AST增高的同时,COX-2表达明显升高,PGD2升高。而使用COX-2抑制剂NS-398,可以抑制PGD2血浆浓度的上升,减少ALT和AST的增高。本实验研究显示,模型组大鼠COX-2表达升高,并伴有肝组织损伤、ASTALT升高等变化,而蜂王浆组COX-2、ASTALT明显降低。以上提示蜂王浆可减轻ALD病程中肝细胞的损伤作用,其作用机制可能是通过降低或抑制Cox-2的生成,避免过度的炎性反应,达到减轻线粒体及脂质过氧化损伤,从而降低血清ASTALT的水平。

本实验研究还发现,蜂王浆降低了TNF-α在肝细胞中的表达,而TNF-α作为炎性因子,介导了肝细胞的炎性反应,免疫反应及肝细胞的凋亡和扩增,肝纤维化等多种病理和生理活动[8]。分析蜂王浆使TNF-α降低的原因如下:蜂王浆是天然的氧自由基清除剂,可以减少ROS引起的核转录因子的活化,从而减少受其调控的TNF-α基因的表达[9]。本研究还证明了TNF-α和COX-2表达存在正相关,蜂王浆降低了COX-2表达,一定程度上也降低了TNF-α的表达,说明它们之间存在某种作用机制。

蜂王浆除了上述作用,还有增加血清白蛋白的营养作用。Kamakura M[10]研究了蜂王浆57 kDa蛋白的生理学作用,发现57kDa 蛋白能增加清蛋白(亦叫白蛋白)的合成, 直接说明了在本实验中蜂王浆组中血清白蛋白升高的原因。

总之,蜂王浆是一种纯天然的、优质的药食两用品,无毒副作用。通过上述研究,其护肝机制是通过营养作用、抗氧自由基等途径实现的,但还有很多其它的途径值得进一步探讨。目前大部分实验直接用COX-2和 TNF-α的抑制剂来对相关疾病进行治疗,本实验通过间接抑制或降低COX-2和 TNF-α的表达,改善肝功能,减轻了ALD ,为临床治疗ALD 提供了一定的理论基础。

 

参考文献

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